实现“定制化”间充质干细胞治疗：基因改造和预激活
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撰文｜摩西
编辑｜南风
正文共：16778字，预计阅读时间：42分钟
近几十年来，MSCs在全球范围内的实验和临床研究中涉及各种疾病，由于其独特的生物学特性，显示出优于常规治疗的治疗效果 [1,2,3,4,5]。它们从围产期组织中分离出来，例如脐带、脐带血和胎盘，以及成人的多种生物组织，包括骨髓、脂肪组织、肌肉和肺 [6,7]。间充质干细胞作为一种多能成体干细胞，具有自我更新和多向分化为脂肪细胞、肌肉、软骨细胞、成骨细胞和神经元细胞的潜力。[8,9]。此外，越来越多的证据表明，MSCs 通过高旁分泌活性发挥免疫调节、修复和再生作用[10,11,12]（图1）。更重要的是，MSCs 具有免疫特权，这意味着异基因MSCs移植不会引起炎症反应，这主要是由于它们缺乏II类主要组织相容性复合物 (MHC-II) 和共刺激分子 [13,14]。这些特点使间充质干细胞成为继造血干细胞之后细胞治疗的理想种子细胞。
间充质干细胞的分离来源和作用机制。该图说明了获取MSCs的各种来源以及与治疗效果相关的生物学特性。
然而，来自不同个体的间充质干细胞的生物学效应具有较大差异，身体的内部环境（生病与否，年轻或年老）会影响分离出的干细胞的质量。例如，从肥胖和2型糖尿病 (T2D)个体中分离出的脂肪来源的MSC (ASC) 表现出功能缺陷，例如细胞凋亡增加、免疫抑制活性降低和干性丧失 [15,16,17]。来自老年供体的MSCs表现出增殖和分化能力受损、免疫调节抑制和生物活性分子分泌减少[18]。此外，一旦进入体内，MSCs可能会很快发生凋亡，因为它们暴露于恶劣的宿主微环境，包括缺氧、氧化应激以及慢性炎症。
据报道，静脉注射非健康个体来源的MSCs只有约28%存活超过1天[19]，不到1%的细胞存活超过一周 [20,21]。即使原位移植，大多数MSCs也会在一周内失去其生物学活性 [22]。此外，大多数注入的MSCs被困在肺微血管而不是靶组织中 [23]。这些不利条件将导致各种问题，例如移植细胞的存活率低，MSCs的迁移和归巢不良，从而限制了输注细胞的功能。
为了达到预期的治疗潜力，本文提出了几种尝试优化干细胞的策略，大致分为两类，即基因改造和预激活（非基因改造）。
在基因改造方面，间充质干细胞会产生或过表达功能基因，使其能够抵抗恶劣的微环境和细胞凋亡，增加迁移和归巢，增强旁分泌作用。几项研究表明，基因转染的MSCs比野生型 MSCs具有更好的治疗潜力 [25,26,27]。然而，安全性是转基因MSCs未来临床治疗应用的最大障碍。据报道，病毒表达系统可以在宿主体内引发免疫和炎症反应，而病毒在宿主基因组中的整合会带来致瘤风险 [28,29]。此外，需要充分阐明基因工程MSCs的治疗潜力和长期功能。因此，开发高效的非基因改造方法，在此统称为预激活，是改善MSCs治疗结果的一种替代和可操作的方法。
MSCs可以被预激活以实现所需的功能并逆转它们的失活，因为它们可以识别微环境中的刺激并记住它们[3,30]。回顾目前的文献，MSCs的预激活主要是基于MSCs存活的体内生理微环境将其在体外进行模拟，称为“生理微环境模拟预激活”。或者MSCs的体外适应性调节是基于疾病的病理微环境，称为“病理微环境模拟预激活”。评论文章的主要目标是提供涉及这两种类型的预激活的具体方法（图2）。
间充质干细胞的分离来源和作用机制。该图说明了获取MSCs的各种来源以及与治疗效果相关的生物学特性。
o1
生理微环境模拟预激活
原代培养中的MSC数量有限。它需要在体外扩增以达到治疗所需的细胞数量，过度的体外操作会导致衰老、干性下降和再生能力受损[23]。在体外保持MSCs的“年轻”非常重要。干细胞生活在组织的特定区域，称为干细胞生态位。它是一个由细胞和非细胞成分组成的多维环境，用于操控干细胞增殖、决定干细胞命运和维持干细胞稳态。涉及许多必要线索的细胞和非细胞成分，即其他细胞（细胞-细胞相互作用）、物理因素（温度、渗透压、拉伸和电信号）、化学因素（PH、氧气、营养物质、离子强度、代谢物细胞因子和趋化因子）和细胞外基质（组成、结构、拓扑结构和刚度）[31,32,33]。在这方面，在体外重建复杂的体内微环境将为MSC的生产提供有益的支撑，并保持其固有的生物学特性。迄今为止，对缺氧和三维 (3D) 培养进行了最深入的研究。
o2
低氧预激活
在体外培养ADCSs可能会面临各种压力，包括物理脱离、温度变化和蛋白酶诱导的细胞损伤，从而导致细胞衰老。
在体外培养的MSCs通常暴露在平均氧分压约为21% [34] 的环境中。然而，MSCs通常存在于低氧微环境中，体内生理氧浓度范围为1%至11% [35,36]。多项研究表明，高氧浓度会导致培养的MSCs受到环境压力，进而诱导DNA损伤和衰老 [37,38]，并使其活性降低[39,40]。因此，低氧是MSCs生理微环境的重要组成部分。缺氧诱导因子 (HIF)，尤其是 HIF-1，是细胞对缺氧反应的关键调节剂[41]。HIF-1是一种异二聚体，包含两个亚基HIF-1α和HIF-1β。O2的缺乏使氧不稳定蛋白HIF-1α积累并易位进入细胞核，然后与HIF-1β 结合形成异二聚体，进一步与靶基因中的缺氧反应元件 (HRE) 结合。CBP/p300等激活剂，然后调节许多基因的转录 [42,43,44]。
低氧预激活对MSCs具有多种有益作用。例如，低氧培养环境保持MSCs的未分化状态。一些报告表明，低氧张力增加了多能干细胞标志物（Oct4、Sox2 和 Nanog）在ASC中的表达，而不会改变它们的表面标志物和形态 [45, 46]。
此外，与常氧状态（20% O2）相比，低氧促进了MSCs的增殖和存活，从而提高了扩增效率以获得更多的ASCs产量[45,46,47,48]。并且在迁移试验中，低氧启动似乎促进了MSCs 在体外的动员[47,49] 并改善了MSCs 在体内的归巢 [50,51]。李等人证明，低氧培养促进 了MSCs的增殖和迁移潜能[34]。Rosová 等人的结果，表明在低氧条件下培养的MSC增强了肝细胞生长因子 (HGF) 及其主要受体cMet的表达，而HGF/cMet是MSC迁移的主要信号[51]。另一项研究发现，低氧预激活通过增加钾Kv2.1通道表达和FAK活性来促进骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 的迁移 [50]。
此外，低氧启动可以保护MSCs免受不利微环境的影响，并保持基因稳定性[37,52]。与常氧培养相比，MSCs暴露于低氧环境时，其寿命延长，可避免复制性衰老，并且表达较少的衰老相关β-半乳糖苷酶 [53]。低氧条件下的MSCs表现出基因稳定性，DNA损伤减少，染色体畸变减少 [37]。低氧培养使MSCs的分泌谱发生变化，旁分泌功能增强。例如，在缺氧条件下，MSCs 中促血管生成因子如 VEGF、HGF 和成纤维细胞生长因子（bFGF）的分泌增加。此外，MSCs的免疫抑制特性在低氧条件下得到改善，抗炎因子上调，抑制CD4和CD8 T淋巴细胞的增殖，促进Treg细胞的生成比暴露于正常氧气的MSCs更有效[56,57]。
值得注意的是，大量实验研究发现，低氧预激活的MSCs比未处理的MSCs显示出更显着的治疗效果。在肺纤维化模型中，与低氧培养的MSCs相比，低氧预活化的MSCs可以明显减轻肺水肿、减轻肺纤维化并改善肺功能 [58]。此外，将低氧MSCs移植到大鼠心肌梗塞模型中会改善受伤部位的血流和减少梗死面积 [59]。此外，与常氧MSCs治疗的糖尿病小鼠相比，链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠接受低氧预活化的MSCs后，随机血糖和空腹血糖显着降低，口服葡萄糖耐量得到改善[40]。
因此，与常氧培养MSCs相比，低氧预处理的MSCs表现出更有利的特性并具有更好的治疗潜力。此外，低氧预活化具有简单、成本低、易于推广、适合大规模细胞生产等优点。然而，在将低氧MSCs进一步应用于临床之前，需要解决几个问题。有必要优化低氧预激活中的氧浓度，因为MSC生活的生理生态位中的氧浓度因组织来源而异（骨髓中为1%至7%，脂肪组织中为10%至15%，脂肪组织中为1.5%至1.5%）[58]。此外，生物安全性是干细胞疗法最受关注的问题，在临床应用前应慎重确定。
o3
3D培养预激活
与传统二维 (2D) 培养环境相比，3D培养系统模仿体内天然MSC微环境，增强了细胞-细胞相互作用或细胞-ECM相互作用，可显着改善MSCs的生物学特性为，如增殖、免疫调节和定向分化[60]。MSCs的3D培养系统，包括多细胞球体、支架和水凝胶，越来越受到关注。
球体培养
球体培养是一种比较简单的增强MSCs生物活性的方法 [61]。已经开发了各种方法来生成 MSC球体，例如悬滴技术、低附着方法以及强制聚集技术 [62]。随着生物材料的发展，生产MSC的球体支架培养平台已经发展起来。
球体培养系统可以通过增加干性和促进分化成不同的细胞谱系来提高MSCs的治疗潜力[57,63]。Cheng等人的研究结果表明，基于壳聚糖薄膜的球体培养可以使间充质细胞系标记CD29、CD90和CD105的下调和多能性相关标记Sox2、Oct4、Nanog和SSEA-4的上调，使MSCs去分化成更原始的状态[45,64]。此外，张等人采用微重力生物反应器生成 MSCs球体，并得出了类似的结论 [65]。球体衍生的MSCs改变了它们的分化偏好，可以转分化为非间充质谱系细胞，如神经细胞和肝细胞 [64,65]。
球体培养系统可以通过提高增殖、迁移和归巢效率来提高MSCs的治疗潜力。与单层MSC 培养相比，球体来源的MSC表现出更高的增殖活性[66]。SDF-1/CXCR4信号通路在移植的MSCs的迁移和植入中起着至关重要的作用。球体培养系统生产的MSCs可恢复由2D培养体系引起的CXCR4表达缺失 [67]。此外，在球体衍生的MSCs中发现基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-13的表达增加，从而促进细胞通过基底膜侵入[66]。
球体培养系统可以通过促进治疗因子（包括免疫调节和促血管生成细胞因子）的分泌来提高 MSCs的治疗潜力。据巴托什等人报道，悬滴模型中的MSCs分泌更高水平的抗炎因子，如肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白（TSG-6），更有效地抑制脂多糖（LPS）刺激的肿瘤巨噬细胞分泌坏死因子-α (TNF-α) [68]。另外的几项研究表明，其他抗炎细胞因子，如前列腺素E2 (PGE-2)、转化生长因子-β1 (TGF-β1) 以及IL-6在球体系统培养的MSCs中也表现出更高的水平 [69,70,71,72] 。此外，由于VEGF、HGF、bFGF 和血管生成素 (ANG) 的分泌显着增加，球体培养来源的MSCs 的促血管生成和促再生功能显著增强 [67,73]。
球体培养优化了间充质干细胞的生物学特性，使其在体内具有更好的治疗效果。巴托什等人证明，在酵母聚糖诱导的小鼠腹膜炎模型中，球体培养系统来源的MSC在抑制炎症反应方面更有效。球体培养系统来源的MSCs治疗组显示血清中的中性粒细胞活性和促炎分子显着降低 [70]。据程等人报道，注射到受损愈合伤口中的球状MSC显着增强了血管生成和愈合效率[66]。Bhang等人的研究证明，与对照组相比，球体培养系统来源的MSC移植组缺血区域观察到更显着的血管生成和更少的纤维化[74]。
然而，球体培养系统的一些缺点也限制了大规模生产MSC [75]。例如，球体培养技术会影响球体大小，而球体大小的可变性会影响MSCs的治疗性能。因此，在临床使用球体培养系统来源的MSC之前，有必要区分临床需求，开发可重复的球体培养系统，并利用动物模型和临床试验确认其安全性和有效性。
脚手架
细胞外基质（ECM）被视为干细胞生存的“土壤”。生态位中的细胞通过整合素的跨膜蛋白机械锚定到ECM [76]。ECM的主要功能是为细胞生长和通过细胞-ECM相互作用，将机械传感信号转导至细胞以提供必要的支撑。它还为细胞提供必需的营养物质和生长因子 [61,77]。因此，有必要在viv中构建工程生态位来模拟原生ECM。生物材料的最新进展促进了MSCs人工ECM培养系统的发展，并且出现了各种天然和合成生物材料[61]。它们应满足基质力学、可降解性和生物相容性等特性。现有的工程化ECM可以改善MSCs的生物学特性，例如增殖、归巢、谱系分化和旁分泌[78,79,80,81]。
支架、薄膜、水凝胶和海绵形式的工程化ECM，已被开发并用于扩增MSC并增强其生物学特性 [82,83,84]。海藻酸盐已广泛用作组织工程中的生物相容性载体。Ewa-Choy等人的工作记录了3D藻酸盐水凝胶创造了一个微环境，促进ASC分化为软骨样细胞。ASC软骨细胞分化的效率取决于藻酸盐浓度[85]。值得注意的是，向ECM支架添加特异性诱导剂将进一步提高MSCs分化为所需细胞类型的效率。多项研究表明，羟基磷灰石(HAp)在骨重塑过程中与预先存在的矿物质相似，并具有优越的骨诱导活性 [86,87]。将BMSCs植入由鸭脚衍生胶原蛋白(DC)/ 含有或不含羟基磷灰石(HAp) 构建的多孔海绵中，以观察它们的成骨分化。在骨传导调节剂地塞米松的诱导下，DC/HAp海绵中的BMSCs表现出更高的增殖活性和成骨分化能力[88]。
接种在工程化ECM支架上的MSC的旁分泌特征和免疫调节作用也发生了显著变化，接种在生物材料中的MSC显示出PGE2和TSG-6等抗炎调节剂的上调。与2D培养体系中的 MSCs相比，海藻酸盐包裹的MSCs可更有效地减弱TNF-α的分泌并增强PGE2的产生 [90]。此外，与单层培养相比，在藻酸盐水凝胶中培养的ASC对植物血凝素刺激的外周血单核细胞的增殖有显着抑制作用[91]。此外，海藻酸盐水凝胶包封的MSC在体外促进巨噬细胞向抗炎M2表型的转化。与对照组相比，它们在大鼠脊髓损伤 (SCI) 模型中发挥了类似的免疫调节作用，因为损伤部位的M2亚群百分比更高 [92,93]。
因此，与2D培养相比，基于支架的3D培养赋予MSCs更优异的生物活性和卓越的治疗效果。随着人们对生物材料的了解，其生物性能也在不断扩大。仅使用生物材料，就可以制造出具有多种功能的仿生复合材料。例如，焦等人开发了一种具有明胶还原氧化石墨烯 (GOG) 和光交联明胶水凝胶的双相仿生原胼胝体，可提供缺氧微环境并介导BMSCs向成骨和血管生成的双向分化，从而促进骨缺损的再生 [94]。因此，新一代基于支架的MSC培养技术不仅要同时从多个方面模拟干细胞生态位，提供尽可能多的干细胞生态位成分，还要释放生物活性分子以靶向效应细胞，激活“自我修复”的机制。
o4
模拟病理微环境预激活
MSC进入人体后，将面临疾病引起的病理微环境。在这种环境中存在多种破坏因素，可导致移植细胞的氧化应激和凋亡，并显着损害MSCs固有的治疗特性。研究人员致力于针对恶劣的病例环境微调细胞的特性，并使其更适用于特定的疾病。基于MSCs的可塑性和记忆能力，创伤微环境中的线索，如环境因素（缺氧）、化学因素（炎症因子和细胞因子），将是MSCs体外操作的主要考虑因素 [95]。此外，MSC的制备工艺也在不断探索求新，如与药物、中药和小分子化合物的结合也相继出现 [28,96,97]。另一个值得关注的是，患者内源性MSCs的生物学特性会随着疾病的发展而改变，表现出功能的丧失和衰退[98,99,100]。因此，提高间充质干细胞的生物学活性，提高其治疗效果，特别是开发为患者定制的治疗性间充质干细胞具有重要意义。
低氧预激活MSC
在前面的章节中已经提到，低氧是干细胞生态位的重要组成部分。实际上，在动物实验和临床研究中，间充质干细胞总是被输送到缺血缺氧的损伤部位。因此，缺氧也是病理环境的重要组成部分 [34]。体外低氧培养可以诱导MSC对损伤微环境的记忆，从而提高治疗效率，这在前几节已有讨论。然而，干细胞生态位和受损组织之间的氧浓度存在差异。此外，受损组织中的局部氧浓度在不同的修复期会有所不同。因此，干细胞预处理的氧浓度因目的而异。例如，MSCs的体外培养是指生理氧浓度，并在其体内应用之前用病理氧浓度进一步预处理。
用炎症因子预激活MSC
炎症因子和细胞因子的预激活被认为是模拟体内炎症微环境的最常用手段，在调节干细胞的免疫调节功能方面发挥着重要作用[3]。TNF-α、INF-γ和IL-1β等促炎细胞因子经常在创伤性微环境中观察到，并被广泛研究用于MSCs的预激活[3]。
用TNF-α预激活MSC
越来越多的证据表明，用与疾病相关刺激对MSCs进行适当的启动可以改善其生物学功能并发挥更好的治疗作用[101]。TNF-α 在缺血和受伤组织中表达，通常用于模拟急性炎症环境 [102]。用 TNF-α预激活牙龈组织衍生的MSCs (GMSCs) 可增强外泌体CD73的表达，这对于诱导抗炎M2巨噬细胞极化至关重要 [103]。来自TNF-α预活化的GMSC的外泌体表现出比对照更强的抗破骨细胞活性，从而减少结扎诱导牙周炎小鼠模型中的牙周骨吸收 [103]。此外，TNF-α预激活的MSC在H2O2诱导的氧化应激下显著提高了增殖、迁移和存活率。并且它们通过大量分泌HGF、VEGF和其他细胞因子发挥比对照MSCs更好的内皮保护功能 [104]。此外，用TNF-α引发的MSC通过分泌促血管生成细胞因子（如IL-6 和IL-8）加速恢复了缺血性后肢和皮肤伤口的血运 [105,106]。
用干扰素 (IFN)-γ 预激活MSC
促炎细胞因子IFN-γ也是用于MSC预激活的代表性因子[107]。作为对IFN-γ的反应，MSCs具有独特的免疫抑制特性，几种抗炎因子的表达增加，例如HGF、TGF-β1、IDO、前列腺素和环氧合酶 2 (COX-2) [108,109,110]。由IFN-γ刺激的MSC分泌的前列腺素和 IDO是抑制NK活化的主要效应物[109]。此外，IL-2/15 激活的NK细胞对IFN-γ刺激的 MSCs的细胞毒性低于未刺激的MSCs，因为它们上调了抑制性MHC I类分子，而IFN-γ引发的MSCs抑制PBMCs增殖的能力比未刺激的MSCs更强[111]，并伴随着PD-L1的上调和COX-2衍生的PGE2分泌的增加[112]。在CCl4诱导的肝硬化 [113]、闭塞性细支气管炎[114] 和肾纤维化[115]模型中，证明MSCs在IFN-γ预激活后的治疗潜力得到显着改善。这一证据表明，间充质干细胞可以被炎症信号激活，并足以增强其免疫调节特性和治疗效果[110]。
用IL-1β预激活MSC
IL-1β也是由单核细胞和巨噬细胞产生的炎症组织中普遍存在的炎症细胞因子 [116]。研究表明，IL-1β预激活增加了MSCs中许多粘附分子的表达，例如整合素 LFA-1，从而通过与ICAM-1的相互作用促进对HUVECs的粘附，从而促进MSC跨内皮细胞和归巢 [117]。此外，Nie等人的研究发现，IL-1β预激活的MSCs表现出升高的CXCR4表达并增加了它们向SDF-1的迁移，导致在急性肝功能衰竭中比初始MSCs具有更好的治疗性能 [118]。此外，来自IL-1β预激活的MSCs的外泌体可以诱导巨噬细胞极化为M2表型，并且比幼稚MSCs产生的外泌体更有效地减轻脓毒症小鼠模型中的症状 [119]。
用其他促炎细胞因子和TLR配体预激活MSC
此外，最近报道了一些其他炎症因子如IL-17A和IL-25作为替代的预激活手段并获得了有希望的结果。IL-17A主要由CD4+T辅助细胞 17 产生，并在发展自身免疫和炎症性疾病中起调节作用 [120]。一项比较研究的结果表明，用 IL-17A 刺激的 MSCs 表现出比未处理的 MSCs 更好的免疫抑制特性 [121]。与 IFN-γ、TNF-α 或 IL-1β 处理的MSCs 相比，IL-17A 处理的MSCs对有丝分裂原活化的CD3 + T细胞的抑制程度最高。IL-25 是细胞因子 IL-17 家族的成员，最近被用于增强MSC调节的免疫反应[122,123]。与未引发的 MSC相比，注入IL-25引发的MSC显着减少了IL-17阳性细胞并增加了FoxP3阳性细胞，从而减轻了 DSS 诱导的结肠炎大鼠模型中的肠道炎症 [122]。
脂多糖 (LPS) 是革兰氏阴性菌外膜的一种成分，在各种疾病中升高。最近的研究表明，LPS 是调节多种细胞类型细胞凋亡的重要介质 [124]。已经证明 LPS 对 MSCs 的生物学效应与使用的LPS浓度密切相关。高剂量LPS处理的MSCs诱导其凋亡，低剂量LPS处理的MSCs增强了其抵抗氧化应激和抑制细胞凋亡的能力，可能取决于细胞FADD样IL-1β转化酶抑制蛋白的上调. 此外，通过MyD88依赖性激活stat3 [124,125,126]，移植低剂量LPS预活化的MSCs在 I/R损伤模型中显着改善了MSC介导的心脏保护作用。
用促炎细胞因子组合预激活 MSC
间充质干细胞经多种促炎因子预激活后，其生物学活性发生变化，因此科学家们设想是否可以通过联合不同的炎症细胞因子对间充质干细胞进行预处理，以弥补效率低下，最大限度地发挥治疗作用。因此，炎性细胞因子的预激活不仅可以提高间充质干细胞抵抗氧化应激的能力，而且在很大程度上增强间充质干细胞的免疫抑制特性，增强其治疗效果。尽管如此，仍有一些问题需要回答。需要深入研究并进一步探索和确定单独或组合炎性细胞因子预激活的最佳浓度和作用持续时间。或者，还应关注炎症预激活的可能副作用，例如I类和II类HLA分子的不良上调。
用生长因子或再生细胞因子预激活 MSC
最近出现了用生长因子或再生细胞因子激活MSC，并已被证明是一种有吸引力的方法。用混合生长因子预激活 MSCs 显示出增强其生物学功能的协同作用。此外，与移植未经处理的MSCs相比，这些预激活的MSCs的移植可减少梗塞面积并改善心脏功能 [136]。然而，为预激活的 MSCs 选择最佳细胞因子并赋予所需的生物学功能是重要的一步。是选择在各种疾病中共同变化的细胞因子，还是使用疾病特异性细胞因子作为预激活条件，是一个需要深入研究的问题。或者，细胞因子预激活的方法不够经济，因为大规模生产预激活的MSC需要大量的细胞因子。
用生物活性化合物预激活MSC
生物活性化合物是一种很有前途的预活化方法，可增强MSCs的生物学特性 [28,96,137]。目前用于刺激间充质干细胞的生物活性化合物按其来源可分为天然（如从中药中提取）和合成化合物；在生物活性化合物的筛选原理上，要么对MSCs有生物调节作用，要么对目标疾病有治疗作用；鉴于其对间充质干细胞的生物学机制，生物活性化合物可分为以下几类：促进存活和迁移，增强分泌活性，恢复和修复失能的间充质干细胞。
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促进间充质干细胞存活和迁移的生物活性化合物
实际上，发挥 MSCs 固有的治疗特性需要移植的细胞在严酷和受损的环境中存活并发挥作用[28]。许多研究都集中在通过使用生物活性化合物来修饰 MSCs 以增强其抗凋亡和迁移能力。
曲美他嗪（TMZ）可降低缺血引起的组织损伤，常用于治疗心绞痛。它通过增加促生存因子如 HIF-1α、Akt、survivin 和 Bcl-2 的表达来保护MSCs免受过氧化氢 (H2O2) 诱导的氧化应激。他达拉非属于长效PDE5抑制剂组，已用于治疗心力衰竭 [138]。它通过上调miR-21以抑制Fas [138,139] 来改善MSCs体外的增殖和存活。此外，阿托伐他汀对内皮功能产生有益的影响[140]，促进了MSCs的存活，并通过eNOS/NO和SDF-1/CXCR4 通路促进MSCs 在梗塞心脏中的治疗作用 [140]。
维生素E是一种众所周知的抗氧化剂，因为它具有清除自由基的活性 [141]。维生素E预激活的MSC对H2O2诱导的氧化应激以及增殖标志物（增殖细胞核抗原和Ki67）和促再生标志物（TGF-β和VEGF）的上调具有抗性。此外，移植含有维生素E的MSC 可修复大鼠骨关节炎模型中受损的软骨 [142]。
近年来，已经研究了中药或其提取物对 MSCs 的有益作用 [143 ]。丹参 (SM) 是一种广为人知的草药，常见于许多中医处方中，用于治疗各种疾病，包括心血管疾病、阿尔茨海默氏症和缺血性中风[144,145,146]。SM有效地增强了MSCs在缺氧条件下的活力并减少了细胞损伤。在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，SM修饰的MSCs的输注显示了梗塞区域的恢复和积极的行为变化 [147]。姜黄素是姜黄 (Curcuma longa) 的活性成分，具有抗氧化和抗炎等多效作用 [148,149]。它通过调节PTEN/Akt/p53 通路和血红素加氧酶1的表达对ASC中的氧化应激诱导的损伤发挥细胞保护作用[150,151]。先前的姜黄素治疗显着增加了 MSCs中VEGF的分泌，并且这些预激活的MSCs在缺血性心肌中比初始ASCs促进了更多的新血管形成和功能恢复 [152]。
此外，姜黄素预活化的MSCs改善了其在酸性烧伤伤口中的治疗潜力，表现出改善微循环、明显的肉芽形成和加速伤口闭合的潜力 [153]。还有许多其他中药提取物，如迷迭香酸 (RA) 和 gigantol，它们通过调节caspase-3、caspase-9和Bax/Bcl-2的表达来保护MSCs免受H2O2诱导的细胞凋亡。PI3K/Akt和ERK1/2信号通路 [154,155,156]。这些结果表明它们可以作为细胞保护剂用于MSC移植。
用于增强MSCs的免疫调节、旁分泌和治疗潜力的生物活性化合物
事实上，间充质干细胞的免疫调节和旁分泌特性与其治疗效果密切相关。最近的数据表明，药理刺激可以增强MSCs的旁分泌和免疫调节潜力。
铁螯合剂去铁胺 (DFX) 是一种具有抗氧化特性的低氧模拟剂。用于预激活MSCs的DFX导致抗炎（IL-4、IL-5和COX2）、促血管生成因子（VEGFα 和血管生成素-1）以及神经保护因子（神经生长因子、间充质干细胞中的胶质细胞衍生的神经营养因子和神经营养因子-3) [157]。DFX预激活的MSC的分泌组可以有效地将LPS诱导的巨噬细胞 DH82 重编程为M2表型[158]。它还显示出背根神经节 (DRG) 神经元在高剂量葡萄糖诱导的损伤下的神经保护潜力 [157]。Treprostinil 是一种前列环素类似物，用于刺激 MSCs 并通过增加 VEGF-A 的产生来发挥促血管生成作用 [159 ]。在全反式维甲酸 (ATRA) 中发现了促生存、血管生成和促迁移相关基因的表达，包括 COX-2、HIF-1、CXCR4、CCR2、VEGF、Ang-2 和 Ang-4经处理的MSCs [160]。此外，与注射未经处理的MSCs 的伤口相比，注射ATRA处理的MSCs的伤口显示出显着更高水平的血管化、胶原沉积和再上皮化，促使伤口加速闭合 [160]。白藜芦醇 (RSV) 是一种植物多酚类化合物，可保护MSCs免受炎症和氧化损伤 [161,162]，增强其旁分泌功能，防止其衰老等 [163,164]。例如，RSV预激活增强了MSCs中 PDGF-DD 的分泌，进一步激活了肾小管细胞中的ERK信号通路，促进了内皮细胞的血管生成，并优选修复了顺铂诱导的肾损伤 [164]。补阳还五汤（BHD）是中医补气活血的名方，用于治疗中枢神经疾病[165]。与未经处理的 BMSCs 相比，BHD预激活的大鼠 BMSCs 衍生的外泌体含有更多的血管生成miRNA，并且在双侧颈动脉结扎后大鼠脑中的血管生成增加 [166]。
高通量技术的发展为我们筛选靶向MSC中特定基因的生物活性化合物，从而调控MSC的表达谱带来了新的视角。例如，汉防己甲素被选择来特异性上调 PGE 2 的表达。MSCs通过 NF -κ B / COX - 2 信号通路预激活的四氢萘MSCs在与小鼠巨噬细胞（ RAW 264.7）共培养后， TNF -α分泌显著减少，小鼠炎症耳朵中肿瘤坏死因子-α水平减弱[167].
用于逆转和修复功能残缺的MSCs的生物活性化合物
围产期组织间充质干细胞在体外大规模扩增后会发生复制性衰老，老年供体间充质干细胞普遍呈现早衰表型，患者的间充质干细胞表现出MSC生物学功能下降。这些MSC通常在增殖、迁移、分化和免疫调节方面表现出细胞功能下调，同时治疗能力受损 [98,99,100]。因此，逆转这些MSCs的功能，即MSCs的再生，对于基于MSC的治疗至关重要。
最近的研究表明，细胞功能下降或过早衰老可以得到挽救 [168]。一般来说，拯救 MSCs 的方法可以广义地定义为降低细胞内氧化应激水平，通过调整表观遗传修饰对 MSCs 进行重编程，以及使用抗衰老药物。
抑制过度氧化应激
数据表明，作为细胞代谢产生的天然副产物，ROS 在 MSCs 中维持在低水平，对 MSCs 的增殖和分化至关重要 [169,170]。在实际老化或病理条件下，高水平的ROS诱导会导致严重的细胞毒性和细胞损伤 [168]。几项研究报道，通过调节细胞内 ROS 聚集和氧化代谢可以逆转发生故障的MSCs [168]。抗氧化剂已成为自然选择，并且有几种抗氧化剂用于 MSCs的抗衰老研究。N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 是一种ROS清除剂，可显着减弱MSCs中 Wnt/β-catenin 信号传导过度激活导致的ROS积累，从而减轻ROS诱导的DNA损伤并下调衰老相关标志物p16 (INK4A)、p53 的表达和p21 [171]。另一种自由基清除剂依达拉奉通过降低 ROS 水平和 β-gal 阳性细胞来挽救老年 AT-MSCs 的功能。此外，它还可以保护BMSCs免受缺氧和UC-MSCs中抗氧化酶上调引起的细胞内ROS积累 [172,173]。更重要的是，用依达拉奉预激活恢复了老年 AT-MSCs 的体内治疗功能，因为缺血皮瓣小鼠模型中的坏死面积减少了 [174]。
总体而言，ROS 可以作为细胞内信使并帮助执行重要的生物学功能，因此必须通过调节抗氧化剂的量来控制 ROS 的最佳浓度。毕竟高剂量的抗氧化剂会导致DNA损伤和过早衰老[175]。
用于修饰表观遗传失调的生物活性化合物
表观遗传调控是一种重要的编程机制，它通过改变基因表达而不是DNA序列来改变细胞表型。它具有遗传性和可逆性的特点，包括 DNA 甲基化和组蛋白修饰，对MSC命运有深远的影响 [176,177]。常规培养扩增后在 MSCs 中发现的表观遗传失调似乎与整体组蛋白乙酰化水平的变化无关，但涉及某些基因启动子的组蛋白乙酰化水平，如TERT、Soc2、Oct4、Runx2 和 ALP，最终导致到细胞衰老 [178]。此外，通过使用BeadChip微阵列，与来自年轻的 MSCs 相比，据报道，来自老年的MSCs的DNA甲基化普遍降低 [179]。鉴于表观遗传修饰的可逆性，探索表观遗传靶向治疗将老干细胞重编程为年轻的功能性干细胞是一种潜在的策略。
使用目前的技术，对衰老干细胞进行重编程的方法主要有两种，即完全重编程和部分重编程。前者是指重置表观遗传时钟以最终获得诱导多能干细胞（iPSCs），但它们抑制T细胞增殖的免疫调节功能不完整 [180,181,182]。因此，需要彻底评估iPSCs衍生的MSCs的治疗效率，尤其是免疫调节功能。此外，由于效率低、iPSC数量有限、成本高，完全重编程在实验室还只是一种手段，离床边还有相当大的距离。部分重编程涉及不完全去分化，被认为是表观遗传返老还童，可以通过使用生物活性化合物调节DNA甲基化和组蛋白修饰来实现 [183]。
组蛋白乙酰化增加、DNA 甲基化和羟甲基化减少以及基因组中 H3K27me3 的明显变化在衰老细胞中普遍存在。然而，通过改变表观遗传修饰来逆转干细胞衰老仍处于起步阶段。有必要绘制出衰老过程中MSCs 的详细表观遗传变化，特别是与MSC生物学特性改变相关的表观遗传特征。此外，不同来源的MSC老化表观遗传变化的普遍性或独特性需要得到证实。
抗衰老药物的使用
Senotherapeutics 是指应用抗衰老药物选择性地消耗衰老细胞或延缓衰老的发生，从而使组织恢复活力并减少与年龄相关的病变的发生 [192]。据报道，有几种化合物具有潜在的抗衰老作用，例如纳维他 (ABT-263)、槲皮素、达那唑、烟酰胺核苷、达沙替尼和二甲双胍 [192,193]。用抗衰老药物达沙替尼治疗，既能选择性地促进衰老MSCs的凋亡，又能显着改善 MSCs的生物学活性[194]。
可以想象，不同药物的组合可能会达到更明显的抗衰老作用。如Zhou等人的研究所示，达沙替尼和槲皮素的抗衰老混合物在体外或体内颅骨缺损模型中，改善了老年小鼠来源的骨髓间充质干细胞的成骨潜力[195]。值得注意的是，一些研究结果表明，达沙替尼和槲皮素的混合物可以减轻衰老细胞的负担，并改善脂肪、骨骼、主动脉和大脑等重要组织的功能 [195,196]。然而，需要更多的证据来支持senolytic鸡尾酒疗法在挽救MSCs功能方面的有效性。
一般来说，这些发现表明生物活性化合物具有改善功能确实的MSC和修复衰老MSC的特性，开发更有效的生物活性化合物来拯救MSCs也是科学家们需要继续努力的方向。此外，生物活性化合物的使用方式也值得仔细考虑。正如几项研究所证明的，使用生物活性化合物作为 MSC 移植的伴随药物，也比单独的干细胞移植具有更好的治疗效果[24,95,197]。尽管如此，慢性病患者还伴随着多种危险因素，例如年龄、糖尿病和心血管疾病。因此，应考虑干细胞移植伴随药物的可能副作用和安全性。MSCs的衰老是一个高度复杂的过程，深入了解衰老的潜在机制，将有助于我们找到更有效的方法来使衰老的MSCs恢复活力。
用疾病相关效应细胞或患者血清预激活 MSC
“个体化MSCs治疗”是指通过体外预激活获得的MSCs具有定制化的功能，可以特异性针对患者的疾病，从而达到更好的治疗效果。因此，增强MSCs的治疗效果，建议直接使用效应细胞或其释放的活性物质作为预激活条件，而不是使用典型的促炎因子、细胞因子或生物活性化合物进行教育。
肥大细胞 (MC) 在速发型超敏反应和过敏反应中起核心作用，也是特应性皮炎 (AD) 发病机制中的主要效应细胞。活化的 MC 释放含有大量生物活性物质的颗粒，例如促炎细胞因子、蛋白质介质、脂质介质和生长因子，可引发过敏反应 [199]。多项研究表明，MSC 在共培养系统中抑制MC活化和脱粒并诱导MC凋亡 [200,201,202]。然后，具有MC颗粒的预激活 MSCs 可能是增强 MSC 靶向治疗 AD 的一种有前途的策略。Lee等人的研究表明，MC颗粒引发的 UC-MSCs 比未引发的细胞表现出更强的免疫抑制性，这是通过上调 COX-2/PGE2 信号通路来中断MCs的增殖和脱粒来介导的[201]。此外，在 dermatophagoides farina 诱导的 AD 模型中，与幼稚细胞相比，皮下输注MC颗粒培养的UC-MSC显示出更显着的MC数量减少并减轻了皮肤中淋巴细胞的浸润 [201]。因此，用效应细胞或其衍生活性物质预激活的间充质干细胞，可以准确靶向疾病发展过程中的主要致病因素，并在体内快速反应和响应，从而达到更有效的治疗效果。
血液循环中炎症因子、趋化因子、生长因子、细胞因子和微泡的改变已在多种疾病中发现，包括阿尔茨海默病、肾病和心脏病[203,204,205]。用患者来源的血清预激活扩增的MSCs 可以使MSCs对宿主微环境做出积极反应 [203]。Tang等人的研究表明，与注射对照血清预激活MSCs的大鼠相比，注射中风血清预激活MSCs的大鼠表现出行为显著改善，炎症细胞因子减弱，脑损伤和凋亡细胞减少，和增加的脑I/R损伤模型中的营养生长因子[206]。此外，在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎大鼠模型中也显示出用疾病衍生血清增强 MSCs 的治疗效果。MSCs用结肠炎大鼠或正常大鼠血清预活化后，收集两种预活化细胞的条件培养基用于治疗结肠炎。前者显示出比后者更加有效地阻止疾病进展，更好地改善临床特征，并且在结肠炎大鼠中的组织学损伤评分低得多[207]。
因此，疾病特异性预激活可能是实现“MSC定制临床治疗”的有希望的手段。而准确捕捉疾病特异性是该策略的必要前提，需要对疾病的生物学机制进行全面深入的探索和分析。
看法
除了通过重建生理和病理微环境来预激活MSCs外，还有其他方法可以预激活MSCs，包括光刺激、磁电刺激和热休克（HSP）等。低水平激光治疗（LLLT）有利于调节多种细胞的生物学功能 [208,209]。例如，与未受刺激的ASC相比，低强度激光刺激的ASC的生物活性增强，表现为提高存活率、增加分泌和加速再生愈合 [210,211]。此外，最近已证明脉冲电磁场通过调节 Akt/Ras 信号通路和上调 Bad 和 Bcl-xL 等存活蛋白对 BMSCs 发挥保护作用 [21]。此外，研究表明，HSP可以诱导细胞保护蛋白并增加抵抗恶劣外部环境的能力 [213,214]。HSP预激活增强了MSCs自噬并增加了它们对H2O2诱导的细胞凋亡的抵抗力。此外，与对照MSCs相比，HSP-MSCs在肝I/R 损伤模型中移植后显示出增强的归巢特性和存活率 [215]。此外，卵巢内注射 HSP-MSC 可挽救受损的卵巢结构并改善内分泌功能 [216]。
一般而言，现有预激活方法的目的是充分利用MSCs的功能可塑性，提前为MSCs赋予所需的特性，以便MSCs再次遇到类似环境时，可迅速响应，启动细胞保护机制。
尽管如此，预激活 MSCs 的应用面临着一些挑战。
一是选择合理有效的MSC预激活方法。迄今为止，已经提出了许多补充方法来提高MSCs的治疗效果，寻找最佳的预激活方式是我们未来研究的重要追求。每种预处理都有望改善MSCs 在临床应用上的效果，例如，将 MSCs 接种到与 bFGF 或 TGF-β1 交联的胶原微载体的可注射凝胶中，以促进其定植和向成软骨分化[217]。此外，基于效应细胞或基于患者血清的 MSCs 预激活可能相对更有针对性地用于疾病治疗，这需要大量的比较研究来进一步确定这一推论。
二是间充质干细胞的异质性，主要表现在两个方面：一是不同来源间充质干细胞的生物学特性存在差异，这意味着作为一种新型细胞药物，间充质干细胞来自不同组织对同一疾病的治疗效果不一致。
此外，当面对相同的预激活条件时，来自不同组织的 MSC 的反应机制会有所不同。例如，刺激/未刺激的 UC-MSCs 与植物血凝素激活的淋巴细胞共培养导致 UC-MSCs 中负共刺激分子 CTLA4 的早期激活，而在共培养的BMSCs中改变了IL-12的表达[219]。这些差异可能部分由来自不同组织的MSC之间的功能异质性决定。
三是开发标准化的生产平台，用于评估预激活MSCs的安全性和治疗特性（图3）。大量研究证据证实，间充质干细胞主要依靠旁分泌发挥生物学作用。MSCs分泌产物主要包含可溶性蛋白和细胞外囊泡，前者包括细胞因子、趋化因子、生长因子，后者可分为外泌体和微泡[220,221]（图1）。因此，准确选择成分作为受过“教育”的MSC的预激活和治疗效果的指标是一个棘手的问题。然而，越来越多的证据表明，移植的MSCs的体内凋亡与多种动物模型中的干细胞治疗效果密切相关，例如GvHD [222]、败血症和急性肺损伤 [223,224]。Pang等人的研究结果进一步说明通过消融BAK/BAX来阻止MSC凋亡会降低它们在OVA诱导的哮喘模型中的免疫调节能力，这表明MSCs的体内生物学机制远比我们想象的要复杂得多 [225]。因此，抑制和抵抗干细胞凋亡作为MSC预激活的常用评价指标值得商榷。
预处理的 MSCs 取得了良好的治疗效果，增强了损伤修复和疾病治疗的能力。
最后，MSC体内治疗的本质是递送促修复调节因子和细胞外囊泡等。因此，研究人员开始使用MSC衍生的可溶性蛋白和细胞外囊泡替代干细胞进行治疗[226,227],其释放受到精确调节，其成分随预激活条件而变化 [228]。该方法可以避免MSCs在体内增殖、分化和分泌不可预测的旁分泌因子的风险。
最近的结果表明，MSCs通过密度梯度离心被去核成“cargocytes”，形成一种仿生递送方法。Cargocytes 保留旁分泌能力，且不增殖，或可永久移植到宿主中。Cargocytes 的应用不仅避免了与直接使用MSCs相关的不良事件，例如肺或脑栓塞，而且还改善了生物分布并增强了对体内靶组织的归巢[229]。因此，来自MSCs的衍生物可能是一种可控的治疗载体，将成为治疗疾病的潜在物质。
结论
总之，尽管预激活的MSCs仍然存在问题，但由于其巨大的再生潜力，它们仍然对治疗各种难治性疾病具有相当大的前景。迄今为止，越来越多的共识是，在各种病理条件下，预激活的MSCs确实比初始MSCs表现出更好的治疗效果。
未来，我们应有效利用“预激活”工具，一方面最大限度地发挥MSCs的治疗潜力，另一方面对其进行修饰使其适合靶向疾病，开启MSCs临床应用的新篇章。
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